免疫染色の違いによる顕微鏡観察の違い、そして、その違いから主張できることの違いが生まれるわけですが、その専門的知識を誰よりも最初に詳細に書いているのが私ですよ😂
その内容が難しいのか知れませんが、学とみ子がそのことを理解できていないだけです。

学とみ子が数行書いた「可能性の視点での所見」とは「栄養外肺葉（trophectderm)由来の細胞というのは、胎児組織（胎児血管壁細胞、胎児血液）とは違うのは当たり前で、TE由来細胞の特徴がある。TE由来は、合胞体構造の連続多核であり、胎盤の最外層にあり、層状にみえる（R４）。胎児血管が多い胎盤中心部(（R5）の組織でも、GFPが強く、核が大きい構造体がある。しっかり見れば、TE由来に近い状態があると、STAP論文図からわかります」ですが、科学的に誤りがあり、しかも「〜からわかります」と断定表現になっています。（学とみ子は科学的な誤り（誤診）を認めようとしません。

STAP 論文（Letter）の Extended Data Figure 2 は通常の顕微鏡による投影断面図 projection image だから、GFP（赤色）、pan-cytoketatin（茶色）の撮影ではその"共在性"は示されていない。つまり、FI 幹細胞は TE/TS 系譜の胎盤細胞に寄与しているとは言えない。

2024年10月13日に「単に胎盤構成細胞にGFPがあるということだけでは混ざっているということに過ぎない」と私は説明しており、そのときの ChatGPT も「FI 幹細胞が胎盤に寄与するためには、それらの細胞が胎盤特有の機能を持つ胎盤に分化し、胎盤の構造の一部を形成している必要があります」「単に胎盤構成細胞にGFPがあるという事実だけではなく、細胞が実際に胎盤細胞に分化して機能的に寄与することを意味します」と説明されており、学とみ子は分化していることの証明が"共在性"を示すことだとは理解していなかったのです。

確か、ため息先生に「切片の図はわかったの？何十枚も切る必要はないのがわかったの？」と学とみ子は言われて、学とみ子は「切片は何枚も作ることと思う」と言ってましたが、"共在性"を示せないサンプルをいくら作っても"共在性"を示せないんですが、その"共在性を示す"ために酵素免疫染色 IHC ではなく、蛍光免疫染色 IF による共焦点レーザー走査顕微鏡によって調べる必要があったわけです。

あと、丹羽先生が「integrate している」と言ったことが、あたかも FI 幹細胞がTE/TS 系譜の胎盤細胞に寄与しているかのように言ったかのように勘違いしていますよね。"integrate"とは、"細胞が組織の構造の中に取り込まれること"を意味します。組織内に存在する、機能参加の可能性はあるが必須ではない。それに対して"分化 differentiation"は"細胞が特定の細胞型の性質を獲得すること"を意味します。特異的マーカーの発言が認められ、形態・機能も特異的になります。

「ES 細胞を PGA シート上で培養し、薄いシートを作り普通の胎盤切片の上に置いた（移植）した場合、これは、「ES 細胞が胎盤細胞に integrateしている」と呼んだりします。

と学とみ子は言っていますが、私は最初からかなり詳細に説明しているんですが、学とみ子の理解が遅いので、私の説明等が変わっているかのように錯覚しているんです。私の説明は一貫性があるのに対し、学とみ子のコメントは Moving Goalposts だと評価されているわけです。

「oTakeさんの頭は、AIに聞き込みを繰り返すうちに、だんだん、整理、修正されていく」のではなく、「oTakeの説明やAIの説明を繰り返し聞くことによって、学とみ子の頭は、だんだん、整理、修正されていく」んですよ。学とみ子は自覚ないんですかね。いや、学とみ子は理解不足だったことを認めたくないんで、防衛機制の投影 projection なんでしょうね😂

さて、胎盤のGFPとTEマーカーの共在性の証明の仕方を私は説明してきましたが、胎盤の分析・解析は確かに高度な技術なんですよ。

1. ① 胎盤の細胞の多層複雑性
2. ② 複数のマーカーの同時染色
3. ③ 共焦点レーザー走査顕微鏡
4. ④ 解析の困難さ

などがあります。小保方のような新米研究者では確実に無理で、実際に無理だったんですね。

小保方はまず、胎盤の切片を作り、GFP（赤色）と TE marker（ブラウン）を見かけ上の投影断面写真を作成したのだと思います。

　これを若山研には「胎盤の切片は陽性（ポジティブ）でした」と報告しています（須田著『捏造の科学者』より）。2013年に胎盤の専門家である丹羽先生にその胎盤の切片を見てもらった時に、通常の蛍光顕微鏡の単一投影断面写真では"共在性"は示せていないことは分かっていたはずです。共焦点レーザー走査顕微鏡での分析・解析等が必要であることは分かっていたはずです。

　STAP 論文執筆時の2013年に、通常の蛍光顕微鏡の単一投影断面写真だけ論文にしようと考えた理由が知りたいですね。

　論文発表後、ES 細胞や胎盤の専門家は、共焦点レーザー走査顕微鏡ではない、通常の蛍光顕微鏡の単一投影断面写真では"共在性がある"証拠にならない、として、FI 幹細胞が胎盤に寄与した証拠はないという扱いになったわけですよ。調査委員会の報告会見での桂委員長の「胎盤であったとは思っていません。あったという証明ができているとは思っていません」という発言にも繋がっています。

　学とみ子は「小保方には胎盤の解析・分析は難しく、理研等のES細胞や胎盤の解析・分析に詳しい専門家の協力が必要で小保方単独ではない」と言いたいのでしょうが、個々の染色などの作業は簡単です。その個々の実験作業を複数組み合わせて、立証する最適な実験計画を立てることが難しいんです。

　実際の実験は下表のように①〜④の流れで行ない、②〜④は最適化を繰り返すことになります。

段階	難易度
① 方法開発 Method Development	難しい
② 条件最適化	やや難しい
③ 実験操作	標準的な操作で容易
④ 結果評価（解析・分析）	やや難しい

　STAP 論文の FI 幹細胞の胎盤寄与解析は、GFP とTE marker の"共在性"を確認するのに酵素免疫染色（IHC）を採用し、通常の蛍光顕微鏡による単一断面図による比較をしています。最初の"実験計画"がど素人のパッケージングだったということです。また、②〜④のフィードバックによる最適化を行なえない"実験設計"だったということです。専門家の関与が"実験計画・設計"の段階からあったならば、"染色計画"で蛍光免疫染色（IF）や"共焦点レーザー走査顕微鏡"を使うことの検討があったはずですが、それが見られません。

　学とみ子によれば「胎盤染色は、理研の高度の技術をつくした成果物であると、AIは、主張を繰り返します」だそうです。そして、その学とみ子のGemini（AI）の回答で『実際にはどうやって「比較」するのか』で① 連続切片法、② 多重蛍光免疫染色（共焦点レーザー走査顕微鏡観察）がありますが、これは私 oTake の回答のパクリですね。まぁ、パクリかどうかはともかく、理研ではこの二種類の観察法を行なっていないので「胎盤染色は、理研の高度の技術をつくした成果物であると、AIは、主張を繰り返します」という学とみ子のコメントは嘘デタラメです。

試料管理に矛盾？

小保方が試料を管理していたのであって、小保方研が試料を管理していたという話ではありませんが、完全に誤情報ですね。

2011〜2012年は小保方管理の試料は、若山研内に小保方の実験試料の保管・管理場所を与えられ、小保方自身が管理していました。2013年1月〜211月頃（小保方研のラボ改修が終わるまで）は笹井研内に小保方の実験試料の保管・管理場所を与えられ、小保方自身が管理していました。

　小保方が独自のラボを持っていることと小保方が試料を管理していることは無関係です。

　「**胎盤の切片を作成し、それを高度な顕微鏡で撮影し、多重染色を成功させるための「インフラ」と「熟練した補助者」**が誰であったのか」と高度な顕微鏡で撮影？「共焦点レーザー走査顕微鏡観察」は使っていませんよね？　そもそも STAP 論文の FI 幹細胞の胎盤寄与解析が高度に成功している前提で Gemini はハルシネーションにより回答しています。

　胎盤細胞を TE marker と GFP を用いて FACS 解析によって、共在性を確認する方法についての実験計画検討（パッケージング）を私が構成してみました（次項：TE markerと GFP を用いて FACS 解析）。これは実験計画（案）の内容です。違いが分かるはずです。

単細胞化にする解離

　胎盤組織から TE marker と GFP を用いて FACS 解析を行なうことは原理的には可能です。実際にはいくつか重要な技術的条件があります。

　まず、胎盤組織は構造が複雑で細胞外マトリックスが豊富な組織であり、細胞同士の接着も強いため、そのままでは FACS にかけることができません。したがって、最初に胎盤組織を単一細胞懸濁液に解離する処理が必要になってきます。

　この解離には通常、酵素処理と機械的分散を組み合わせた方法が考えられます。具体的には、トリプシンやコラゲナーゼ、DNase などの酵素を用いて細胞外マトリックスや細胞間接着を分解し、組織をほぐしていき、その後、ピペッティングなどの機械的分散を行い、さらに 70 µm 程度のメッシュフィルターを通すことで細胞塊を除去し、単一細胞懸濁液を作製するという方法です。ただし胎盤由来細胞は比較的壊れやすいため、酵素処理が強すぎると細胞膜や抗原が損傷し、FACS 解析に必要な表面 marker が失われる可能性があるため、細胞の生存率を保ちながら単細胞化する条件の最適化が重要になってくるでしょう。

TE marker の染色

　次に、TE（trophectoderm）marker の染色についてです。
　TE 系譜を示す marker としては Cytokeratin 8 や Cytokeratin 18 などがよく用いられますが、これらは細胞膜ではなく主に細胞質内に存在するタンパク質です。このような細胞内抗原を抗体で検出する場合、細胞を固定し膜を透過させる処理が必要になってきます。固定・透過処理を行った場合、細胞は生きた状態ではなくなるため、その後の培養などを目的とした生細胞ソーティングはできなくなります。
　一方、もし TE 系譜を示す細胞表面 marker が利用できる場合には、生きたまま蛍光抗体で染色し、そのまま FACS ソートを行うことも可能でしょう。

GFP について

　GFP については、通常は細胞内で発現する蛍光タンパク質であり、励起光を当てることで直接蛍光を発するため、生細胞のまま検出することができます。そのため、GFP を発現している細胞は FACS で比較的容易に識別できるか思います。ただし、TE marker 抗体の蛍光色と GFP の蛍光スペクトルが重ならないように、例えば GFP を緑、抗体標識を赤や遠赤にするなど、蛍光チャンネルの設計には注意が必要となるでしょう。また、細胞の処理条件や保存状態によっては GFP の蛍光強度が低下する場合もありそれを考慮に入れなければなりません。

　実験技術上の制約としては、TE marker が細胞内抗原である場合には固定・透過処理が必要になるため、生きた状態の TE 陽性かつ GFP 陽性の細胞を分離することは難しいという点があります。また、胎盤には栄養膜巨大細胞などの大型細胞や多核細胞が含まれており、これらは FACS 装置での取り扱いが難しい場合もあります。そのため、細胞の損傷やロスが増える可能性を考慮し、十分な細胞数を確保するためには比較的大きな組織量を想定しておかなくてはいけません。

まとめ

　以上をまとめると、胎盤組織から単一細胞を単離し、TE marker と GFP を指標として FACS 解析やソーティングを行うことは理論上実験可能と言えます。

　ただし、生細胞としてのソーティングが可能かどうかは使用する TE marker の性質に依存します。
　細胞表面 marker であれば生細胞のまま分離できますが、Cytokeratin のような細胞質 marker の場合には固定細胞での解析に限られます。
　また、胎盤組織特有の細胞構造や解離の難しさから、細胞の生存率低下や細胞損失が生じやすい点にも注意が必要です。
　実験では通常、胎盤組織を解離して単細胞化した後、蛍光抗体で染色し、FACS によって GFP 陽性かつ TE marker 陽性の細胞集団を解析あるいは分離し、その後に遺伝子解析や培養、追加の免疫染色などの下流解析を行うという流れになると思います。

　上記、TE markerと GFP を用いて FACS 解析を行なうことは理論的に可能であり、FACS でも共在性（同一細胞内での共発現）は示すことができると考えられます。

　ただし、その示し方は顕微鏡での共局在（co-localization）とは科学的意味が少し異なります。

　まず、FACS の場合は細胞を単一細胞懸濁液にして1細胞ずつ蛍光強度を測定しています。
このとき、GFP 蛍光とTE marker 抗体の蛍光という2つの蛍光チャンネルを同時に測定しています。

　測定結果は通常、2次元ドットプロットとして表示されます。

　横軸に GFP 蛍光、縦軸に TE marker 蛍光をとると、細胞は4つの集団（① GFP− / TE−、② GFP＋ / TE−、③ GFP− / TE＋、④ GFP＋ / TE＋）に分かれるわけですね。

　この GFP＋ / TE＋ の象限（ダブルポジティブ集団）が存在すれば、同一細胞で両方のシグナルが検出されたことになります。

　したがって、FACS では「同一細胞が2つの marker を同時に持つか」という意味での共在性（共発現）を定量的に示すことができるということになります。

　ただし、顕微鏡像で言う「共局在」とは少し違います。顕微鏡では、同一細胞内でさらに空間的に同じ場所にあるか（例えば細胞膜上か、細胞質内か）まで観察できますが、FACS ではそこまでは分かりません。FACS が示すのはあくまで同じ細胞に両方の蛍光があるかどうかという情報です。

　まとめると、胎盤組織を単細胞化して FACS 解析を行えば、GFP とTE makrer のダブルポジティブ細胞の割合を測定することで、同一細胞での共発現（共在）を示すことは可能です。ただし、細胞内の位置関係まで示すものではなく、その点は顕微鏡による免疫染色や共焦点観察とは役割が異なるという認識が必要です。

　この方法による観察では、細胞内局在やマルチヌクレオセルの影響など、断面図情報でわかる情報は得られないため、共焦点レーザー走査顕微鏡による Z-stack 撮影を行なうことで補完できる。

　胎盤組織における TE 系譜細胞の CAG-GFP 発現を同一細胞レベルで評価するためには、まず胎盤ブロックを単一細胞懸濁液に解離し、TE marker を蛍光抗体で染色した上で FACS にかけます。手順の流れは以下の通りです。

1. 胎盤組織の前処理

1-1 胎盤ブロックの切り出し

　ホルマリン固定・パラフィン包埋で保存された胎盤試料から 1〜2 mm 程度の小片を切り出し、氷冷 PBS または HBSS 中で保持します。
　切片は均一に解離できる大きさに調整します。

1-2 酵素処理による解離

　組織は接着性の高い細胞外マトリックスを持つため、酵素処理で単細胞化します。一般的にはコラゲナーゼ（例：Type II、1 mg/mL）および DNase I（0.1 mg/mL）を含む培地で 30〜60 分 37 ℃ 振とうし、必要に応じてトリプシンを追加します。
　ただし過度な処理は細胞膜や表面 marker を損傷する可能性があるため、条件は慎重に最適化します。

1-3 機械的分散と濾過

　ピペッティングなどで組織塊をほぐし、70 µm メッシュフィルターを通して単一細胞懸濁液を作成します。細胞数と生存率をトリパンブルー染色などで確認し、生存率 70〜80 ％以上を目標とします。

2. TE markerの蛍光染色

2-1 表面 marker の場合

　CDX2 や EpCAM などの表面抗原を選択し、生細胞のまま蛍光抗体で染色します。氷上で 30 分程度インキュベートし、PBS + 1％ BSA で洗浄して余分な抗体を除去します。

2-2 細胞内 marker の場合（例：Cytokeratin 8/18）

　細胞を 4％ PFA で固定後、0.1％ Triton X-100 で透過処理してから蛍光抗体で染色します。固定細胞では生きたままのソートや培養はできません。

3. GFP の扱い

　CAG-GFP は細胞内で発現する蛍光タンパク質であり、励起光を当てると直接蛍光を発するため、生細胞で直接検出可能です。TE marker 抗体の蛍光色が GFP と重ならないように設定します。（例：GFP = FITC、TE = PE または APC）。
　また、細胞は暗所で保持し、蛍光退色を防ぐ。

4. FACS 解析

4-1 細胞のゲーティング

　FSC/SSC で細胞群を選択し、死細胞や細胞塊を除外し、FSC-H vs FSC-A や SSC-H vs SSC-A を用いてシングルセルのみを解析対象とします。

4-2 蛍光シグナル測定

　GFP と TE marker 　の二つのチャンネルを同時に測定します。2次元ドットプロットに GFP（横軸）と TE（縦軸）をプロットすることで、GFP+/TE+ のダブルポジティブ集団を特定できることになります。

4-3 共在性の定量化

　GFP+/TE+ 集団の割合を計算することで、単一細胞レベルでの共在性を定量的に評価できます。FACS では細胞内の位置関係は分かりません、同一細胞で両方の蛍光が検出されるかの共在性を示すことが可能です。

5. 注意点

① 胎盤には多核細胞や大型細胞が含まれるため、FACS で損傷する可能性がある。
② 細胞質 markerを用いる場合は生細胞ソートが不可能な点。
③ GFP 蛍光は処理や保存条件で減衰するので、なるべく早く解析する必要がある点。
④ 陰性対照（GFP 非発現細胞や TE marker 非発現細胞）を必ず使用してゲーティングを設定する。

　共焦点レーザー走査顕微鏡による観察により、細胞内の局在、組織・細胞構造を得られます。しかし、定量的には不正確であり、解析対象細胞数が少ないなどの限界があります。一方、FACS による解析では、同一細胞での共発現を定量的に得られます。しかし、細胞内の空間的局在や組織構造は不明となってしまう限界があります。この両者の観察・解析手法を併用することにより、定量的情報（FACS）と空間的情報（共焦点）を同時に得られ流ことが期待でき、科学的信頼性の向上、大型細胞・多核細胞への対応、解析内容の相互補強が見込めます。

実際の実験実施のフロー

① 胎盤組織を単一細胞懸濁液に乖離する

　ホルマリン固定・パラフィン包埋で保存された胎盤試料から、FACS 解析用小片と共焦点レーザー走査顕微鏡観察用試料に分ける。この際、共焦点用の試料は固定・透過して蛍光抗体染色を行う。

② FACS による解析

　GFP と TE marker のダブルポジティブ集団を定量解析する。集団の割合や統計的信頼性を確保する。

③ 共焦点レーザー走査顕微鏡による観察

　FACS で解析した marker の細胞をスライドに固定し、細胞内の局在、形態、多核性などを観察する。

④ 統合解析

　FACS で得た「何％の細胞が共発現か」という定量的情報と、共焦点で得た「細胞内での marker 分布」という空間的情報を示すことで同一細胞内の共発現とその局在の両方を確実に示すことができる。

＊留意点

• GFP と抗体蛍光がスペクトルが重ならないように設計すること。
• FACS では生細胞解析も可能だが、共焦点用は固定する必要がありその違いに注意すること。

　STAP 論文（Letter）Extended Data Figure 2a には ES placenta（上）、FI-SC placenta（下）が比較画像として挙げられています。

　2014年様々な疑惑があがり、Extended Data Figure 2a は下記のようにES placenta（上）、FI-SC placenta（下）の画像を比較し、FI-SC placenta の画像の方には不可解な線状に並んだ泡状の画像が写っており、これが何であるか謎になっていました。

ES placenta（上）



FI-SC placenta（下）

＊画像は泡状 artifact が目立つように画像強調しています。

　PGA シートを用いた移植や組織工学の標本では、よく見られる scaffold（足場材料）由来 vacuole artifact であることがほぼ確実になりました。

　数枚の PGA シート（3 x 3 x 1 mm）に ES 細胞 を播種し、抗 GFP 抗体による免疫染色等で赤色に染めます。そして、作成したその複数枚の PGA シートを 10 mm 程度の胎盤切片に移植し、integrate させ、胎盤層と ES 細胞層（GFP）を試料を重ね合わせあたかも1層のように見せかけ FI-SC placenta 画像を捏造した疑いが濃厚です。

　若山先生によれば、研究室内で小保方晴子氏らと議論していた際、「胎盤にも分化する幹細胞を作ることができれば、研究の価値がより高まるのではないか」という話が出たことが、FI幹細胞の胎盤寄与研究のきっかけであったとされています。その後、若山氏は作製したキメラマウスの胎児および胎盤試料を小保方氏に渡し、解析を任せていました。

　ある時、小保方氏から「胎盤が GFP で光っているのではないか」との報告があり、撮影された試料画像を確認したところ、胎盤が蛍光を示しているように見える画像が存在していました。若山先生自身も同様の条件で撮影を行っており、その結果が Letter Figure 1b とされています。

　Letter Figure 1a と 1b を検討すると、撮影条件によって観察結果が変化することが示唆されました。

　通常条件では蛍光は観察されず、撮影条件を変更すると、ES細胞でも胎盤が褐〜緑色に見えるという現象が存在していた可能性があります。この結果は、観察されたシグナルが GFP 由来蛍光 、胎盤組織の自家蛍光のどちらであるかを、この段階では判断できないことを意味しました。

　そのため若山研究室では、「胎児血液が胎盤に流れ込んで光っている可能性もあるため、胎盤切片を作製して解析すべきである」との判断がなされ、小保方氏に切片解析が指示されたということですね。

細胞種	設定a	設定b
ES 細胞	写らない	褐〜緑色
FI 幹細胞	写らない (Letter Fig. 1a)	褐〜緑色( Letter FIg. 1b)

　Letter Figure 1b を詳細に観察すると、画像中には褐色調のシグナルが確認できます。このシグナルは画像処理によって緑色蛍光に近い色調へ補正されている可能性があります。補正前の状態に近づけて観察すると、胎児と胎盤の色調は明確に異なっています。この差は、以下のような 胎盤特有の自家蛍光で説明可能です。胎盤は血液量が非常に多い組織であり、ヘム関連分子による広帯域の光吸収・散乱やコラーゲン・細胞外マトリックス（ECM）の青〜緑領域の弱い蛍光、脂質や代謝産物による広帯域の背景蛍光などが重なり、緑〜褐色の自家蛍光として観察されることがあります。したがって、Figure 1b のシグナルは GFP ではなく胎盤自家蛍光である可能性が極めて高いと考えられます。

Letter Figure 1 a（補正前）


Letter Figure 1 b（補正前）


Letter Figure 1 b（補正後）

　小保方はこの四種の結果を無視し、ES 細胞によるものは胎盤に寄与せず、FI 幹細胞によるものは寄与しているようです、と Letter Fig.1 で誤った主張をしたわけです（これは後に論文撤回の理由の一つになっています）。

　小保方は FI 幹細胞由来のキメラマウス胎児・胎盤切片試料を作ったが、CAG-GFP が検出されないことが分かっているので、数枚の PGA シート（3 x 3 x 1 mm）に ES 細胞 を播種し、抗 GFP 抗体による免疫染色等で赤色に染め、そして、作成したその複数枚の PGA シートを 10 mm 程度の胎盤切片に移植し、integrate させ、胎盤層と ES 細胞層（GFP）を試料を重ね合わせあたかも1層のように見せかけ FI-SC placenta 画像を捏造したのではないかと思われます。その切片試料を丹羽先生に見せたわけですが、共焦点レーザー走査顕微鏡による観察ではないので、GFP 等の共在性を示せておらず FI 幹細胞の TE/TS 系譜の寄与が極めて曖昧になっていたわけですね。

　その後、小保方は丹羽先生に切片サンプルを見せて、GFP が検出されており「GFPがポジティブ（陽性）でした」とあたかも共在性の証明ができているかのように若山先生は信じ込ませていたわけですね。

悪意ある誤訳

という記事が Nature 側から出た。

　Nature の原文の“I did it and found it myself,”をどう解釈するかですが、この2つの it は "reproducing Obokata’s results"です。小保方の実験結果（再現現象・結果）です。具体的には「小保方氏から"胎盤が GFP で光っているのではないか」との報告があり、同試料を若山先生自身も同様の条件で撮影を行ない確認したところ、胎盤が蛍光を示しているように見える画像を撮影した（Letter Figure 1b）という内容です。

　小保方は「（若山先生が FI 幹細胞に胎盤に寄与している）現象を新たに発見した」と"found"を「発見する」「見つける」という意味に意図的に誤訳しています。発見したのは小保方であって、若山先生ではありません。小保方は何故、経緯を改ざんするんでしょうかね。

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